実験の詳細

第1日

1. CHO 細胞の準備

細胞培養用フラスコで継代培養した CHO 細胞の対数増殖期に、翌日～90％コンフルエントとなるよう、マルチウェルプレートに播種する。CHO 細胞を細胞剥離緩衝液で剥がし細胞数をカウント後、24穴であれば \(1.5 \times 10^{5}\) 個/ウェルとなるように播種する。細胞のコンディション、バイアビリティ等により増殖速度が多少変化するため \(0.5 \times 10^{5}\) 個～ \(2.0 \times 10^{5}\) 個/ウェル位の範囲で播種し、遺伝子導入時に最も状態の良い細胞数のウェルを選ぶと良い。

2. 遺伝子導入 DNA の準備

ろ過滅菌水に溶解させた高純度プラスミドDNA（260 nm と280 nm の吸光度の比が1.8～1.9 程度）など遺伝子導入を行うDNA を準備する。市販のプラスミド精製キット等でも十分な純度は得られるが、エンドトキシンの影響が懸念される場合は市販のキットで除去する(1)。吸光度測定により定量しておく（DNA（μg/mL）＝（260 nm における吸光度）×吸光係数（二本鎖 DNA の場合50）×（セルの光路長（mm）/10））

第2日

3. CHO 細胞へのリポフェクション（以下は Lipofectamine 3000 の24穴プレートを用いた際の標準プロトコールに即している）

リポフェクションを行うウェルの上清を吸引し、新しい液体培地を加えてインキュベーターへ戻しておく。滅菌セラムチューブを2本用意し、1本には 25 μL の Opti-MEM に0.75あるいは 1.5 μL のLipofectamine 3000 Reagent を加えよく懸濁させる。もう1本には 25 μL の Opti-MEM に 0.5 μg の DNA と 1.0 μL の P3000 Reagent を加えよく攪拌させる。それぞれを混合し、室温で10～15分静置後にウェルに添加し、プレートを軽くゆすって混合する。

第3日以降

4. 目的蛋白質の発現確認

24～72時間後にレポーター遺伝子を共発現させているような場合は、細胞抽出液のアッセイや、in situ での染色を行う。特にレポーター遺伝子等がない場合、分泌蛋白質であれば、培地上清を用いた ELISA やフローサイトメトリー、あるいは細胞傷害性試験などの各種アッセイにより発現を確認することができる。

5. 遺伝子導入 CHO 細胞の継代

リポフェクション後、48時間程度経過後に選択抗生剤の添加を開始する。この際、ウェルがコンフルエントであれば、一旦細胞剥離緩衝液で剥がし、4ウェル程度に展開播種する。抗生剤は最終濃度（G418 であれば 0.5 mg/mL 程度）の1/4から1/2程度の濃度からはじめ、増殖等を考慮しながら数日ごとに濃度を上昇させ、培地交換を繰り返す。発現が安定するまでに数日から数週間有する。

6. 限界希釈法によるクローニング

増殖が安定したら限界希釈法により安定産生株を樹立する。細胞を剥がしカウント後、1ウェルあたり1細胞以下になるように細胞懸濁液を調製する。200 μL ずつ12連マルチピペッターを用いて、96 穴プレートに播種し、37℃でインキュベートする。栄養分の枯渇が心配な場合、途中で 100 μL 程度の液体培地を追加しても良い。培養液は選択抗生剤を入れたものを使用し、プレートは通常数枚用意する。10日ほどで各ウェル中にコロニーが形成されている様子が顕微鏡で観察できるようになる。この時点で、複数のコロニーが見られたウェルはチェックを付けるなどして除外する。細胞抽出液のアッセイや、in situ での染色により、目的の蛋白質を発現しているクローンを選択する。特に分泌蛋白質の場合は、培地上清を用いた ELISA などにより定量的に評価することで、より産生量の多いクローンを取得可能である。

工夫とコツ

ベクターの選択

各社とも様々な発現ベクターを販売しているが、選択抗生剤耐性も選ぶ大きなポイントである。動物細胞用の選択抗生剤は、何れも高価なものが多いが、その中で G418 は、比較的安価であるため、通常良く使われる。導入した遺伝子の欠落を防ぐために、クローニング後も添加し続けることが多いので思い切って大容量のものを購入するのも手である。一方で、目的蛋白質の大量調製に向けた拡大培養の際には、選択抗生剤を添加せず、細胞も使い捨てとすることが多い。

リポフェクション試薬

リポフェクションは Thermo Fisher Scientific 社製の Lipofectamine 3000 添付のプロトコールに即しているが、リポフェクション試薬は、各社から販売されている。用いる細胞種、CHO のサブクローンによっても至適な試薬を選択する必要がある(1)。また、導入する遺伝子に応じて細胞数、DNA 量等を変化させ、最適化することで効率を上昇させることができる。

共発現

動物細胞を用いた発現は、共発現が比較的容易に行えることも大きな魅力の一つである。プロモーター等の構成が、すべて同一であっても選択抗生剤耐性が異なれば利用可能であり、市販のベクターは通常、複数の選択抗生剤耐性を有するものが用意されている。共遺伝子導入は、前述のプロトコールの中で、それぞれのDNA を等量混合後、リポフェクションを行い、クローニングは液体培地に複数の抗生剤を添加して行う。実際、筆者らも G418 とハイグロマイシン耐性ベクターを用いた共発現で、分子間ジスルフィド結合を伴う分子量 200 kDa を越える人工設計した組換え蛋白質の調製に成功している(2)。

クローンの選択

クローンの取得の際は、コロニーの大きさも1つの指標とする。大きなコロニーのクローンは1細胞あたりの産生量が低い可能性があり、また小さなコロニーのクローンは1細胞当たりの産生量が高くても、その後の大量調製に向けた培養時に、増殖が遅く時間を費やす可能性がある。長期培養における産生の安定性もクローンに大きく依存する。このため極力複数のクローンを選択すると共に、細胞数を揃え、1細胞当たりの産生量を評価することも重要である。

遺伝子増幅

クローニングにより～1 mg/L 程度の生産量が期待できるが、思うような量が得られない場合、またより生産量を向上させたい場合は遺伝子を増幅させる必要がある。DHFR（Dihydrofolate reductase）系や GS（Glutamine synthetase）系などがよく知られており、前者は、DHFR の拮抗剤である MTX（methotrexate）の添加に呼応して、dhfr 遺伝子が増幅する現象を利用している。dhfr 欠損 CHO として知られる DG44、あるいは DXB11 などに対して、dhfr 遺伝子との共発現ベクター、あるいは dhfr 発現ベクターとの共遺伝子導入を行う。その後 MTX の濃度を徐々に上昇させることで増幅させる。各段階ごとにクローニングを行うことで、より高産生の株を樹立することが可能だが、通常優に数ヶ月有してしまう。

プラスミドの直鎖状化

ゲノム DNA へのインテグレーションを考えた場合、目的遺伝子が切断されるのを防ぐため、予め環状の DNA を制限酵素を用いて直鎖状化させることが古くから行われているが、10 kb 程度のプラスミドでは効率はさほど変わらないようである(1)。

文献

1. 落合孝広 青木一教, 遺伝子導入なるほど Q&A, 羊土社 (2005)
2. Asano, R. et al., J. Biol. Chem., 282, 27659–27665 (2007)

実験の詳細

第1日

1. CHO 細胞の準備

細胞培養用フラスコで継代培養した CHO 細胞の対数増殖期に、翌日～90％コンフルエントとなるよう、マルチウェルプレートに播種する。CHO 細胞を細胞剥離緩衝液で剥がし細胞数をカウント後、24穴であれば \(1.5 \times 10^{5}\) 個/ウェルとなるように播種する。細胞のコンディション、バイアビリティ等により増殖速度が多少変化するため \(0.5 \times 10^{5}\) 個～ \(2.0 \times 10^{5}\) 個/ウェル位の範囲で播種し、遺伝子導入時に最も状態の良い細胞数のウェルを選ぶと良い。

2. 遺伝子導入 DNA の準備

ろ過滅菌水に溶解させた高純度プラスミドDNA（260 nm と280 nm の吸光度の比が1.8～1.9 程度）など遺伝子導入を行うDNA を準備する。市販のプラスミド精製キット等でも十分な純度は得られるが、エンドトキシンの影響が懸念される場合は市販のキットで除去する(1)。吸光度測定により定量しておく（DNA（μg/mL）＝（260 nm における吸光度）×吸光係数（二本鎖 DNA の場合50）×（セルの光路長（mm）/10））

第2日

3. CHO 細胞へのリポフェクション（以下は Lipofectamine 3000 の24穴プレートを用いた際の標準プロトコールに即している）

リポフェクションを行うウェルの上清を吸引し、新しい液体培地を加えてインキュベーターへ戻しておく。滅菌セラムチューブを2本用意し、1本には 25 μL の Opti-MEM に0.75あるいは 1.5 μL のLipofectamine 3000 Reagent を加えよく懸濁させる。もう1本には 25 μL の Opti-MEM に 0.5 μg の DNA と 1.0 μL の P3000 Reagent を加えよく攪拌させる。それぞれを混合し、室温で10～15分静置後にウェルに添加し、プレートを軽くゆすって混合する。

第3日以降

4. 目的蛋白質の発現確認

24～72時間後にレポーター遺伝子を共発現させているような場合は、細胞抽出液のアッセイや、in situ での染色を行う。特にレポーター遺伝子等がない場合、分泌蛋白質であれば、培地上清を用いた ELISA やフローサイトメトリー、あるいは細胞傷害性試験などの各種アッセイにより発現を確認することができる。

5. 遺伝子導入 CHO 細胞の継代

リポフェクション後、48時間程度経過後に選択抗生剤の添加を開始する。この際、ウェルがコンフルエントであれば、一旦細胞剥離緩衝液で剥がし、4ウェル程度に展開播種する。抗生剤は最終濃度（G418 であれば 0.5 mg/mL 程度）の1/4から1/2程度の濃度からはじめ、増殖等を考慮しながら数日ごとに濃度を上昇させ、培地交換を繰り返す。発現が安定するまでに数日から数週間有する。

6. 限界希釈法によるクローニング

増殖が安定したら限界希釈法により安定産生株を樹立する。細胞を剥がしカウント後、1ウェルあたり1細胞以下になるように細胞懸濁液を調製する。200 μL ずつ12連マルチピペッターを用いて、96 穴プレートに播種し、37℃でインキュベートする。栄養分の枯渇が心配な場合、途中で 100 μL 程度の液体培地を追加しても良い。培養液は選択抗生剤を入れたものを使用し、プレートは通常数枚用意する。10日ほどで各ウェル中にコロニーが形成されている様子が顕微鏡で観察できるようになる。この時点で、複数のコロニーが見られたウェルはチェックを付けるなどして除外する。細胞抽出液のアッセイや、in situ での染色により、目的の蛋白質を発現しているクローンを選択する。特に分泌蛋白質の場合は、培地上清を用いた ELISA などにより定量的に評価することで、より産生量の多いクローンを取得可能である。

工夫とコツ

ベクターの選択

各社とも様々な発現ベクターを販売しているが、選択抗生剤耐性も選ぶ大きなポイントである。動物細胞用の選択抗生剤は、何れも高価なものが多いが、その中で G418 は、比較的安価であるため、通常良く使われる。導入した遺伝子の欠落を防ぐために、クローニング後も添加し続けることが多いので思い切って大容量のものを購入するのも手である。一方で、目的蛋白質の大量調製に向けた拡大培養の際には、選択抗生剤を添加せず、細胞も使い捨てとすることが多い。

リポフェクション試薬

リポフェクションは Thermo Fisher Scientific 社製の Lipofectamine 3000 添付のプロトコールに即しているが、リポフェクション試薬は、各社から販売されている。用いる細胞種、CHO のサブクローンによっても至適な試薬を選択する必要がある(1)。また、導入する遺伝子に応じて細胞数、DNA 量等を変化させ、最適化することで効率を上昇させることができる。

共発現

動物細胞を用いた発現は、共発現が比較的容易に行えることも大きな魅力の一つである。プロモーター等の構成が、すべて同一であっても選択抗生剤耐性が異なれば利用可能であり、市販のベクターは通常、複数の選択抗生剤耐性を有するものが用意されている。共遺伝子導入は、前述のプロトコールの中で、それぞれのDNA を等量混合後、リポフェクションを行い、クローニングは液体培地に複数の抗生剤を添加して行う。実際、筆者らも G418 とハイグロマイシン耐性ベクターを用いた共発現で、分子間ジスルフィド結合を伴う分子量 200 kDa を越える人工設計した組換え蛋白質の調製に成功している(2)。

クローンの選択

クローンの取得の際は、コロニーの大きさも1つの指標とする。大きなコロニーのクローンは1細胞あたりの産生量が低い可能性があり、また小さなコロニーのクローンは1細胞当たりの産生量が高くても、その後の大量調製に向けた培養時に、増殖が遅く時間を費やす可能性がある。長期培養における産生の安定性もクローンに大きく依存する。このため極力複数のクローンを選択すると共に、細胞数を揃え、1細胞当たりの産生量を評価することも重要である。

遺伝子増幅

クローニングにより～1 mg/L 程度の生産量が期待できるが、思うような量が得られない場合、またより生産量を向上させたい場合は遺伝子を増幅させる必要がある。DHFR（Dihydrofolate reductase）系や GS（Glutamine synthetase）系などがよく知られており、前者は、DHFR の拮抗剤である MTX（methotrexate）の添加に呼応して、dhfr 遺伝子が増幅する現象を利用している。dhfr 欠損 CHO として知られる DG44、あるいは DXB11 などに対して、dhfr 遺伝子との共発現ベクター、あるいは dhfr 発現ベクターとの共遺伝子導入を行う。その後 MTX の濃度を徐々に上昇させることで増幅させる。各段階ごとにクローニングを行うことで、より高産生の株を樹立することが可能だが、通常優に数ヶ月有してしまう。

プラスミドの直鎖状化

ゲノム DNA へのインテグレーションを考えた場合、目的遺伝子が切断されるのを防ぐため、予め環状の DNA を制限酵素を用いて直鎖状化させることが古くから行われているが、10 kb 程度のプラスミドでは効率はさほど変わらないようである(1)。

文献

1. 落合孝広 青木一教, 遺伝子導入なるほど Q&A, 羊土社 (2005)
2. Asano, R. et al., J. Biol. Chem., 282, 27659–27665 (2007)

改訂履歴

2020年12月22日 改訂

• 「所属」を修正
• 「装置・器具・試薬」を一部改訂
• 「実験の詳細」に記載の試薬・培地の種類や添加量を一部改訂
• その他、全体に渡って、語彙・文章を適宜修正・追記