On Column Refolding法による大腸菌封入体からの蛋白質精製

京都大学大学院農学研究科応用生命科学専攻

  • 邦文引用竹原清日, 蛋白質科学会アーカイブ, 1, e026 (2008)
  • キーワード精製、Refolding、封入体、IMAC、His-tag
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概要

On Column Refoldingとは、蛋白質を変性条件下でカラムに固定し、移動相の変性剤濃度を徐々に下げて、カラム上でRefoldingさせる手法のことである。組換え型蛋白質の生産において、大腸菌が持つ低コスト・高生産効率は圧倒的であるが、この系ではしばしば、多量発現された目的蛋白質が菌体内で封入体を形成する。利用者はまず、目的蛋白質をいかにして多く上清画分に得るか工夫を凝らすが、それが困難な場合、封入体を変性させてRefoldingさせる方法を検討する。Refoldingには、希釈、透析、ゲル濾過などの方法があるが、まずは希釈法を試すのが定法である。本稿では、希釈法で行詰った場合の第二・第三の選択肢として、His-tag (Histidine tag)を持つ蛋白質をIMAC(Immobilized Metal-Affinity Chromatography)担体に固定し、On Column Refoldingさせる手法について紹介する。

実験手順の概要

封入体の精製と変性 [1日]
 ↓
IMAC担体の準備[30分]
 ↓
IMAC担体に変性させたHis-tag蛋白質を結合(バッチ法) [30分]
 ↓
担体をカラムに詰め、平衡化する [60分]
 ↓
変性状態でHis-tag蛋白質を溶出(変性状態での精製)[15分]
 ↓
溶出蛋白質を再びバッチ法でNi-キレート担体に結合 [30分]
 ↓
担体をカラムに詰め、カラムを平衡化する [60分]
 ↓
蛋白質のOn Column Refolding [1時間~overnight]
 ↓
RefoldingしたHis-tag蛋白質を溶出する [15分]

On Column Refolding法を実施する前に:検討事項チェックリスト

On Column法を試す前に、以下の条件をクリアしているかどうか確認すること。

□ 目的蛋白質にHis-tagが付いている
□ Ni-NTA(QIAGEN社製)のようなIMAC担体が研究室にある
□ XKカラム(GE Healthcare社製)のような空カラムが研究室にある
□ 濃度勾配がつけられるFPLCまたはHPLCシステムが研究室にある
□ 目的蛋白質は、pH7~8くらいの条件でRefoldingが可能である
□ 目的蛋白質はCysを含まない

まず、カラムへの固定にHis-tagを利用するので、His-tag蛋白質であることが必須である。そして、IMAC担体やカラム、RefoldingのためのFPLCシステム等が必要である。これらの器具・機器は、組換え型蛋白質の精製を実施している研究室では保有している場合が多いが、比較的高価な品なので、On Column法をトライするためだけに新規購入するのは高リスクである。また、IMACの性質上、pH7~8くらいの条件でRefoldingできる蛋白質でなければならない。

この手法の一番の問題点は、Cysを含む蛋白質では実施が極めて困難なことである(文献上では成功例がいくつもある)。含Cys蛋白質のRefoldingには酸化・還元反応のコントロールが重要であるが、IMACは原則還元条件下では行えない。最近では比較的還元剤に強い担体が販売されているが、それでも長時間(overnight)、変性剤存在下での使用に耐える商品は、筆者がこれまで色々試した範囲では無かった。希釈法で上手くいかない蛋白質の多くがCysを含むだけに、この欠点はなり痛いが、以下に挙げるOn Column Refolding法の成功例(1-9)や総説(10, 11)等を実施の参考にして頂きたい。

On Column Refolding法の利点

□ カラムに固定することで蛋白質分子間に一定の距離が確保できる。従って、Refolding中間体どうしが結合して起こる凝集反応が阻止できる。
□ Refoldingステージごとに温度やbufferの組成を自在に変えることができる。例えば、初期段階では界面活性剤を添加し、4℃でRefoldingさせることで急激な構造形成によるmis-foldingを抑制する。その後は25℃にて界面活性剤と変性剤を速やかに減らし、迅速にRefoldingを進める—など、条件を自在に変えることができる。
□ バッチ法で担体を繰り返し利用するので、ゲル濾過のようにカラムを壊す心配がない。

On Column Refolding法の成功例

蛋白質名(UniProt番号、 酵素番号、 アミノ酸残基数、 参考文献)で表記する。

  • human prion protein(P04156, 253AA, 文献1)
  • bovine prion protein(P10279, 264AA, 文献2)
  • Interleukin-4(P05112, 153AA, 文献3)
  • DevS histidine protein kinase(P95194, EC 2.7.3.-, 578AA, 文献4)
  • Glutamyl-tRNA reductase(P0A6X1, EC 1.2.1.70, 418AA, 文献5)
  • α-Tocopherol transfer protein(P49638, 278AA, 文献6)
  • β-glucosidase(P49235, EC 3.2.1.21, 566AA, 文献7)
  • exopolyphosphatase(Q7Z032, EC 3.6.1.11, 383AA, 文献8)
  • N-Carbamoyl-D-amino acid amidohydrolase(Q44185, EC 3.5.1.77, 304AA, 文献9)

試薬・器具

  • Ni-NTA agarose (QIAGEN社製30230) [*1]
  • XK16/20カラム (GE Healthcare社製18-8773-01)[*2]
  • グラスフィルター:内径67mmくらいが使いやすい
  • グアニジン塩酸塩(Gdn-HCl, SIGMA社製G4630)[*3]
  • buffer A:6M Gdn-HCl-10mM imidazole-0.1M NaCl-20mM Na-リン酸, pH7.8 [*4] [*5]
  • buffer B:6M Gdn-HCl-300mM imidazole-0.1M NaCl-20mM Na-リン酸, pH7.8
  • buffer C:6M Gdn-HCl-0.1M NaCl-20mM Na-リン酸, pH7.8
  • buffer D:10% glycerol-6M Gdn-HCl-0.1M NaCl-20mM Na-リン酸, pH7.8 [*6] [*7]
  • buffer E:10% glycerol-0.1M NaCl-20mM Na-リン酸, pH7.8 [*6] [*7]
  • buffer F:10mM imidazole-20mM NaCl-20mM Na-リン酸, pH7.8
  • buffer G:300mM imidazole-20mM NaCl-20mM Na-リン酸, pH7.8
  • Lysis buffer:20mM Na-リン酸-0.5M NaCl-10mM imidazole-1mM EDTA, pH7.8
  • Washing buffer:0.1% Triton X-100-20mM Na-リン酸-0.1M NaCl-10mM imidazole, pH7.8
  • 塩化リゾチーム(SIGMA社製L2879など)
  • プロテアーゼインヒビターカクテル(Roche社製11-873-580-001など)

【Tips】

*1: Ni Sepharose (GE Healthcare社製)や、予算が許せばTaylon(Clontech社製)でも可。担体洗浄時に0.5M NaOHを使用するので、これに耐える支持体であること。

*2: 担体の入れ替えが簡単で、恒温槽に接続して温度コントロールができるXK カラムがお勧め。サイズは16/20くらいが使いやすい。

*3: ★重要★変性剤はグアニジン塩酸塩(Gdn-HCl)を使用する。

文献では、変性剤に尿素を使用する例が圧倒的に多いが、これは変性剤を大量に使用するこの系において、Gdn-HClが尿素より高コストであるためだと筆者は推測している。しかし、尿素に比べGdn-HClは以下の点で使いやすい。

  (1) 尿素溶液はpHが上昇しやすく原則用時調製だが、Gdn-HCl溶液は数週間保存可能。

  (2) Gdn-HClの方が変性能が高く、8M尿素で完全に変性しない蛋白質が、6M Gdn-HClではランダム状態にまで変性する場合が多々ある。

  (3) 8M 尿素は4℃では尿素が析出するため使用できないが、6M Gdn-HClは4℃でもGdn-HClが析出せず使用可能。

 On Column Refoldingにおいて、封入体の変性が不完全な場合、Refolding効率が下がる傾向がある。よって、筆者はGdn-HClの使用を強く勧める。コストに関しては、SIGMA社製G4630(5 kgで約¥25,000)を使用すれば尿素と大きな差はない。この製品は固化防止剤として0.4%のSiO2を含むが、bufferに溶解後、遠心し、フィルターで濾過すれば除くことができる。また、SiO2を含まない5kgで4万円弱の製品もいくつか販売されている。

*4: 緩衝液にTris、 HEPES、 MOPS系を使用しない(Niイオンを還元するため)。リン酸またはリン酸-クエン酸系を使用する。

*5: imidazoleは非His-tag蛋白質の結合を避けるために添加する(0~20mM)。

*6: 長時間カラムに流し続けるbufferなので、imidazoleを添加しない。

*7: glycerolは蛋白質の凝集抑制のための添加剤である。目的蛋白質の性質により、他の糖や界面活性剤、Argなどを添加しても良い。また、このような添加剤を全く使用しなくても良い。

実験手順の詳細

以下はCysを含まない蛋白質で実施する場合の手順である。

I. 封入体の精製と変性

(1) 5~10gの菌体をよく冷やしたLysis bufferに懸濁し、プロテアーゼインヒビターカクテル(適量)と40mgの塩化リゾチームを加えて全量40mLとなるよう調製する。これを、氷水上で30分間インキュベーションする。

(2) 容器を氷水につけたまま超音波破砕機で菌体を破砕し、その後3500 gで15分間遠心する。

(3) 得られた不溶性画分を約100mLのWashing bufferに懸濁する。この時、Washing bufferは少しずつ加えて菌体がダマにならないようにする。ガラス棒やボルテックスミキサーを駆使しても均一に懸濁できない場合は、超音波破砕機を使う。

(4) 遠心→沈殿画分の回収→Washing bufferへの懸濁を5~10回繰り返して封入体を精製する。白い片栗粉のような沈殿物のみになればOK。沈殿物の上に茶色のブヨブヨしたものが残っている場合は洗浄が不十分である。

(5) 沈殿物をbuffer Fに懸濁し、遠心して沈殿画分を回収する。この洗浄操作を2回繰り返す。

(6) 得られた沈殿画分をガラス棒等でかき混ぜてよくほぐしてから(重要!)、30mLのbuffer Aを加え、素早くガラス棒とボルテックスミキサーを駆使してかき混ぜ沈殿を溶かす。少々沈殿が溶けずに残っても次のステップで溶けるので心配はない。

(7) 遠沈管にフタをし、室温にて15~60分間シェーカー上でゆっくりと転がして蛋白質を変性させる。60分以上振とうしても沈殿が残る場合は超音波破砕機を使用してもよい。

(8) 変性蛋白質溶液を10000gで20分間遠心し、上清をフタ付き瓶(250mLくらいでガラスよりも樹脂製がよい)に回収する。これを4℃で保存し、16時間以内に次のステップへ進む。数日置く場合は、手順(5)が済んだ段階の沈殿を-25℃で保存する。

II. 変性状態での精製

(9) Ni付加済みのNi-NTA agarose(約50mL、 以下Ni-NTAと略する)をグラスフィルターにあけ、減圧しながら純水で洗浄する。

(10) buffer Aを100mL注ぎ、スパテラで担体を傷めないよう軽く混ぜ、自然落下でbuffer が落ち切るのを待つ。この操作を2回繰り返す。

(11) buffer Aで洗ったNi-NTAを手順(8)で準備した変性蛋白質溶液に入れる。始めはスパテラを使って入れ、グラスフィルターやスパテラに残ったNi-NTAは洗瓶に入れたbuffer Aで洗い流して入れる。

(12) 室温で30~60分間、シェーカー上で容器をゆっくりと転がして担体にHis-tag蛋白質を結合させる。

(13) XKカラムをbuffer Aでリンスした後、上記担体をbuffer Aで洗いながらカラムに詰める。少々泡や隙間があっても問題ないので、手早く詰めること。

(14) カラムをFPLC(またはHPLC)システムに接続し、3ベッド容量のbuffer Aをカラムに流して担体を洗浄する。流速は、カラムの耐圧範囲であれば、5mL/minくらいまでOK。

(15) buffer Bを流してHis-Tag蛋白質を溶出する。圧が許せば流速は5mL/minでよい。

(16) 目的蛋白質に相当するピーク画分を手順(8)と同様のフタ付き瓶に回収する。その後、OD280などにより、蛋白質濃度を定量する。

【Tips】

  • この「II.変性状態での精製」を行うところがこのプロトコールのポイントである。文献で報告されているOn Column Refolding法のほとんどは、この精製ステップを省略している。しかし、封入体変性物からいきなりRefoldingすると、目的蛋白質がプロテアーゼに切られたりmis-foldingしたりする割合が増え、収率が著しく低下する。また蛋白質量が不明であるため、Refolding条件を一定にすることが困難である。変性状態で一度アフィニティー精製し、蛋白質量を明確にしてから、On Column Refoldingへ進むことを強く推奨する。

III. 蛋白質のOn Column Refolding

(17) 手順(16)の蛋白質液をbuffer Cで10倍希釈し、imidazole濃度を下げる。

(18) 以下、手順(9)~(14)と同様にして蛋白質をNi-NTAに結合し、カラムの準備をする。ただし、Ni-NTAの量は蛋白質量に応じて調整する。[8][9] また当然ながら、IIで使用したNi-NTAを未洗浄のまま使用してはならない。できれば前日までに、IIとIIIで使用するに足る洗浄済Ni-NTAを準備しておく。

(19) FPLCシステムにbuffer D、 buffer Eをセットする。また、カラムと恒温槽を適当なチューブで繋いで、目的の温度セットにする。

(20) 流速は1~2mL/min(または線流速0.5~1cm/min)で、2ベッド容量のbuffer Dをカラムに流す。

(21) FPLCの濃度勾配プログラムを使ってGdn-HCl濃度を徐々下げ、蛋白質をRefoldingさせる。[*10]

(22) 流速1~2mL/min(または線流速0.5~1cm/min)で、2ベッド容量のbuffer Fをカラムに流す。

(23) buffer GでHis-Tag蛋白質を溶出する。圧が許せば流速は5mL/minでよい。

(24) 目的蛋白質に相当するピーク画分を回収し、イオン交換クロマトグラフィーなどで更に精製を進める。[*11]

【Tips】

*8: 先の「II.変性状態での精製」ではプレパックカラムを使用しても良いが、On Column Refoldingは必ずバッチ法で蛋白質を担体に結合させること。すでにカラムに詰められた担体に蛋白質を結合させると、カラムの上流に蛋白質が集中し、Refolding効率が低下する。

*9: Ni-NTAは1mL当たり、5~10mgの蛋白質結合容量を有するが、蛋白質濃度が高いとRefolding効率が低下する。筆者は蛋白質10mgに対し、50mLのNi-NTAを使用している。

*10: Refolding条件(温度、 濃度勾配のパターン、 添加剤の有無など)は蛋白質により千差万別なので、まずは文献を参考に決める。しかし、既にfolding過程がある程度分かっているものであれば、それを基に系を構築すれば良い。よく使われる条件は、25℃において8ベッド容量のbufferを線流速0.5~2cm/minで流し、変性剤をリニアーで0 Mにまで下げていくというパターンである。

*11: この試料は相当量のmis-folding蛋白質を含むので、更なる精製が不可欠である。しかし、この試料をいきなりMono-Qなどに通すと、mis-foldingした蛋白質がカラムに結合し、カラムにかかる圧が急上昇して、最悪の場合、カラムを壊す破目になる。 筆者のお勧めは、まずはこの試料をHiTrap Q HP (GE Healthcare社製17-1154-01)に通してmis-folding蛋白質を除き、その後必要に応じてMono-Qやゲル濾過で精製する方法である。HiTrap Q HPはこの試料を流しても圧の上昇が少なく、定法通りのNaCl濃度勾配ではfoldした蛋白質が溶出し、mis-foldingした蛋白質はカラムに貼り付いて出てこないので、mis-folding蛋白質のふるい分けができる。このカラムに貼り付いたmis-folding蛋白質は、0.5M NaOH-1M NaClをカラムに通せば落ちるので、HiTrap Q HPカラムの再生・再利用は可能である。

Ni-NTAの洗浄

 カラム上で蛋白質をRefoldingさせるため、相当量のmis-folding蛋白質が非特異的相互作用で担体に結合する。よって担体は以下の手順で速やかに洗浄し、再生すること。ただし、蛋白質により、下記に示したNaOHでの洗浄に加え、界面活性剤や酢酸、プロパノール等を用いた洗浄も必要な場合がある。また、「II.変性状態での精製」で使用したNi-NTAは、下記(3)(4)のステップを省略して洗浄すればよい。

試薬

  • 0.3M EDTA-Na-1M NaCl, pH8.0
  • 0.5M NaOH-1M NaCl
  • 0.1M Na-リン酸-1M NaCl buffer, pH7.8
  • 0.1M NiSO4

(1) Ni-NTAをカラムからグラスフィルターへ移す。Ni-NTAは高価なので、洗瓶に入れた純水でカラムを洗い、極力無駄のないようグラスフィルターへ移す。

(2) 0.3M EDTA-Na-1M NaCl(pH8.0) を約100mL注ぎ、スパテラで担体を傷めないよう軽く混ぜ、自然落下で液が落ち切るのを待つ。この操作を2回繰り返す。Niの青味が残っている場合は、更にこの操作を繰り返す。

(3) 0.5M NaOH-1M NaClを約100mL注ぎ、手順(2)と同様の操作を2回繰り返す。

(4) 減圧しながら約500mLの0.1M Na-リン酸-1M NaCl bufferで担体を洗う。

(5) 減圧しながら純水で担体を十分に洗う。

(6) 0.1M NiSO4を約100mL注ぎ、スパテラで担体を傷めないよう軽く混ぜ、自然落下で液が落ち切るのを待つ。

(7) 手順(5)と同様に洗浄する。

(8) 1週間以内に使用する場合は4℃にてミリQ水中で保存する。しばらく使用しない場合は4℃にて20%エタノール中で保存する。

参考文献

  1. Zahn R.,et al, FEBS Lett., 417, 400-4 (1997)
  2. Yin S-M.,et al, Protein Expr. Purif., 32, 104-9 (2003)
  3. Razeghifard MR, Protein Expr. Purif, 37, 180-6 (2004)
  4. Saini DK.,et al, Protein Expr. Purif, 25, 203-208 (2002)
  5. Schauer S.,et al, Protein Expr. Purif, 31, 271-275 (2003)
  6. Panagabko C.,et al, Protein Expr. Purif, 24, 395-403 (2002)
  7. Zouhar J.,et al, Protein Expr. Purif, 17, 153-162 (1999)
  8. Lemercier G.,et al, J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., 786, 305-309 (2003)
  9. Chen HM.,et al, Biotechnol. Prog., 19, 864-873 (2003)
  10. Holzinger A.,et al, QIAGEN News, 4, 14-15 (1996)
  11. Jungbauer A.,et al, Curr. Opin. Biotechnol., 15, 487-94 (2004)