概要

イオン交換カクロマトグラフィーは、大量のタンパク質を高い分解能で分画することができることから、タンパク質の初期精製から最終精製まで、非常に幅広く使用されるクロマトグラフィーである。現在、イオン交換クロマトグラフィーに使用されるイオン交換体には、さまざまな担体があり、タンパク質を精製する時に、これらの担体を使いこなすことにより、純度の高いタンパク質を得ることができる。本プロトコールでは、タンパク質精製の鍵となるイオン交換クロマトグラフィーの使用方法について一例を挙げて解説する。

原理

イオン交換クロマトグラフィーは、タンパク質の表面電荷とpHの関係が固有であることを利用して分離する手法である。イオン交換クロマトグラフィーの担体であるイオン交換体は、陰イオン交換体（正に帯電した担体）と陽イオン交換体（負に帯電した担体）の２つに分けられる。タンパク質は、等電点（pI）と等しいpHでは、電荷がゼロとなるため、可溶化しない。pIより塩基性のpHに可溶化したタンパク質は、負に荷電し陰イオン交換体と結合する。また、pIより酸性のpHに可溶化したタンパク質は、正に荷電し陽イオン交換体と結合する。

装置・器具・試薬

• AKTA explorer 10S (GE Healthcare)
• MonoQ 5/50 GL (GE Healthcare)
• バッファーA [20 mM Tris-HCl(pH7.5), 5 mM EDTA, 5 mM 2-mercaptoethanol, 10% glycerol] 200 mL
• バッファー B [20 mM Tris-HCl(pH7.5), 5 mM EDTA, 5 mM 2-mercaptoethanol, 10% glycerol, 1M NaCl] 200 mL

バッファーには、2-mercaptoethanolが含まれているため長期保存したい場合には、2-mercaptoethanolを抜いた組成で4℃保存し、使用する直前に加えると良い。

実験手順

イオン交換クロマトグラフィーを使用したタンパク質精製の一例として、相同的DNA組換えタンパク質である大腸菌RecAタンパク質の最終精製課程における陰イオン交換体を用いた精製について紹介する。RecAタンパク質は、分子量37,973、pI 5.09のタンパク質である。RecAタンパク質の可溶化バッファーをpH 7.5とすると、pI値よりも高いため陰イオン交換体に吸着することが考えられる。本プロトコールでは、陰イオン交換体の1つであるMonoQ 5/50 GL（GE Healthcare）を使用する。MonoQは、非常に高い分離能と高い結合容量を有する多孔性粒子であるMonoビーズ基盤とし、イオン交換体としてQuaternary ammonium (Q)を持つ強陰イオン交換体である。メーカーの取り扱い説明書によるとMono Qの結合容量は、HSAを用いた場合65 mg/ml gelである。MonoQ 5/50 GLは、カラム容量が約1 mLであり、スケールアップしたい場合は、カラム容量が8 mLのMonoQ 10/100 GL を使用するとよい。MonoQカラムに使用するバッファーおよび添加するタンパク質は、HPLCの流路の詰まりを防ぐため、あらかじめ0.22μmのフィルターに通しておく。

１）カラムの平衡化
２）タンパク質の添加
３）カラムの洗浄
４）タンパク質の溶出、分画
５）溶出されたタンパク質の確認
６）カラムの洗浄