計算の詳細

1. アミノ酸配列の用意

構造を予測したタンパク質のアミノ酸配列がAF2/CFの入力となる。アミノ酸配列はUniProtデータベース等から入手できる。ダウンロードされたファイルはfasta形式となっており、これをそのまま次のCFの入力に利用できる。なお多くのタンパク質では、UniProtのStructure欄にX線結晶構造解析等で得られた既知構造とともにAF2によって予測された構造も記載されている。こうしたAF2予測構造はAlphaFold Structure Database (9) にまとめられている。構造予測を始める前にまずこの情報も見てみると良いだろう。

2. ColabFoldによる構造予測

CFは以下のようにして実行できる。

$ colabfold_batch --num-seeds 20 --max-msa 512:1024 input.fasta ./output_dir/

input.fasta が上記1で入手したfasta形式のアミノ酸配列であり、予測結果は output_dir 下に保存される。output_dir に保存される出力は構造ファイル（PDB形式）と予測スコアである（予測スコアについては次の3で言及する）。ここで用いたオプションの意味は以下の通りである（ここでは用いていないオプションについてはCFのGitHubページを参照のこと）。

• --num-seed：乱数の種の数を指定する。上の例では20を指定。乱数の種ごとに5つの予測構造モデルが出力されるので、ここでは合計100構造が得られる。
• --max-msa：MSAの中から実際に構造予測に使用されるアミノ酸配列の数（これを “MSAの深さ” と表現することがある）を指定する。2つの整数を指定し、前者はMSAをクラスタリングした後に実際に予測に用いられるクラスターの数、後者はそれとは別に追加で選ばれ構造予測時の情報として用いられる配列の数である。小さな値を設定すると “浅い” MSAを用い構造予測が行われる。

例として、硝酸と亜硝酸を輸送するトランスポーターNarKのアミノ酸配列（UniProt ID: P10903、アミノ酸残基数：463）に対し構造予測を行う場合、著者の計算環境（GPU: NVIDIA A4000, CPU: Intel Core i7-12700）では2時間弱で100構造が得られる。

3. MSAサブサンプリング

AF2/CFではクエリ配列からMSAを構築し、MSAに含まれる類縁タンパク質のアミノ酸配列集団をランダムにサブサンプリングして構造予測を行う。MSAサブサンプリングによって集める配列数（MSAの深さ）は、CFのオプション --max-msa によって指定される。AF2/CFはMSAから得られるアミノ酸残基間の共進化情報を構造予測に利用しているので、MSAの深さを浅くすることで共進化情報の統計的不確かさが増大し、多様な構造状態が予測できるようになる (10)。

先に例として挙げたNarKについて、オプション--max-msa の値を 512:1024、256:512、128:256、64:128、32:64、16:32、8:16 と減らしていったときの予測構造の分布を図1に示す (5)。トランスポータータンパク質は外開き、閉、内開きの三構造状態を交互に切り替えることで基質を輸送するが、深いMSA（例えば 512:1024）では内開き構造のみが予測されてしまう。一方で、MSAを浅くしていくと閉構造や外開き構造も含んだ幅広い構造状態が予測されていることがわかる。なお、この例のNarKでは外開き構造は実験的に得られておらず、CFによって未解明構造も予測できることを示している。予測構造の信頼性は、CFが出力するいくつかのスコアによって評価できる。例えばpLDDTスコアはアミノ酸残基周囲の局所環境の信頼性を0から100までの数値で表し、値が大きいほど信頼性が高いことを示す。NarKについて予測された外開き構造を図2で示し、pLDDTスコアに従って各残基を色付けしている。N末端やC末端など柔軟性が高く特定の構造をとらないような領域を除いて、高い信頼度で予測構造が得られていることがわかる。

CFの構造予測にバイアスがある際、どの程度MSAを浅くすれば良いかは決まった指針があるわけでなく、タンパク質ごとに異なる。そのため手探りで幾通りかの深さを試す必要がある。このときMSAを毎回構築し直す必要はなく、始めに作ったMSAを次回以降は利用できる。CFではa3m形式のMSAファイルを出力するので、MSAの深さを変えて次に予測を行う際は、先述の2で示した colabfold_batch コマンドにおいて input.fasta をこのa3m形式のMSAに置き換えれば良い。

一般にはより浅いMSAを使うほど予測構造の多様性が増加する。しかし浅いMSAでは統計的不確かが増大するため、信頼性の低い構造が予測される可能性があることに注意が必要である。NarKの構造予測を例にすると、試みた中で最も浅いMSA（--max-msa 8:16）では膜貫通ヘリックスが部分的にほどけた構造（図3上段）や、誤ったトポロジーをもつ構造（図3下段）が出てきてしまう。そのためスコアと構造の確認を十分に行う必要がある。

4. Direct Coupling Analysisと変異導入

上記3では、MSAのサブサンプリングに含まれる統計的不確かによって共進化情報を乱し、複数構造状態を予測できるようにした。しかし、もしMSA内の共進化情報を事前に知ることができれば、高い共進化傾向によってバイアスをもたらしているアミノ酸残基ペアに変異を導入することで異なる構造状態を予測きるはずである。この方法を最後に紹介したい。

MSA内の共進化情報を抽出する方法はいくつかあるが、ここではDirect Coupling Analysis（DCA）を用いる。DCAは、pythonであればpydcaを導入することで簡単に実施できる (8)。pydcaはpython 3.5以降の環境であれば用いることができ、コマンドライン上で

$ pip install pydca

を実行することで導入できる（著者はpython 3.5.4、pydca 1.23を利用）。

CFのMSAはa3m形式で出力されるが、pydcaではFASTA形式を入力とする必要がある。クエリ配列には存在しない領域（挿入領域）について、a3m形式では類縁タンパク質のアミノ酸配列を小文字で表し、FASTA形式ではクエリ配列側に “-” を入れる（FASTA形式の場合、大文字と小文字の区別はない）。今回興味があるのはクエリ配列に存在する領域の中での共進化情報なので、挿入領域を考慮する必要がない。そのため例えばLinuxであれば

$ tr -d a-z msa.a3m | grep -v "#" > msa.fasta

などとすれば良い（a～zの小文字を削除し、#で始まるコメント行を削除してmsa.fastaに保存している）。

pydcaはpythonスクリプト内およびコマンドライン上で使用できるが、ここではコマンドラインで実行する方法を示す。

$ plmdca compute_fn PROTEIN msa.fasta --max_iterations 500 --num_threads 6 --apc

plmdcaは疑尤度最大化DCAを実施することを意味する（平均場DCAを用いるmfdcaもあるが、一般に疑尤度最大化の方が信頼性が高いとされる）。compute_fn は、残基間の共進化スコア計算にFrobeniusノルムを用いることを指定し、PROTEIN は入力となるMSA（msa.fasta）がタンパク質のアミノ酸配列の集合であることを指定している（pydcaはRNAの塩基配列も対象にできる）。オプション --max_iterations は疑尤度最大化のイテレーション回数の最大値、--num_threads はスレッド数、--apc は共進化スコアをaverage-product correlationによって補正することを意味する。それぞれの詳細については、文献 (8,11) を参照のこと。

pydcaの出力ファイルには1、2列目にペアとなる2つの残基番号、3列目に共進化スコアが記載され（図4）、正に大きなスコアをもつ残基ペアほど共進化傾向が強い。あとはこの結果をもとに共進化傾向の強い残基ペアに変異を導入すれば良いのだが、ここで注意すべきことがある。それは、図4に示すように高い共進化スコアをもつ残基ペアの多くは同じ二次構造内や同じドメイン内に存在することである。しかし例えばトランスポータータンパク質の場合には、外開き、閉、内開きの3構造状態でドメイン間の残基–残基コンタクトに顕著な変化が生じる。よって、共進化スコアが高く、かつ野生型配列で予測された構造状態に特有のコンタクト残基ペアに変異を入れなければ意味がない。構造状態特有のコンタクトを特定することは容易ではないが、実験や分子シミュレーション等の情報があれば、それと共進化情報を組み合わせ変異導入先を決めると良いであろう。

例えば図5に示すように、シュウ酸トランスポーターOxlTではAF2の構造予測が外開き構造に偏る。そこで外開き構造（および閉構造）に特有のコンタクト残基をMD計算によって特定し、その中から共進化スコアが高い残基ペアG140-D280（図4緑下線）に変異を導入した。G140-D280は外開き構造のとき水素結合を形成し安定化しているため、D280を疎水性残基に変更（ここではロイシンを選択）し水素結合が形成できない変異型とした。すると、D280L変異型では期待通り内開き構造が得られることがわかった（アラニン等、他の疎水性残基への変異でも同様の結果が得られる）。この変異では外開き構造を不安定化することで内開き構造の予測を可能にしたが、それとは異なり内開き構造を安定化するような変異を導入することもできる。図5に示すように、内開き構造に特有のコンタクト残基ペアをシステインに変異することで、CFはジスルフィド結合を形成させようと内開き構造を予測するようになる。

複数構造状態の探索の簡便性でいえば3で述べた浅いMSAをまず試みた方が良いであろう。しかし変異による方法は、単なる構造探索のみならず構造状態間の安定性を変化させる変異候補の情報を提供できるという利点がある。AF3も登場したことにより、タンパク質構造予測は今後複合体等のより大規模で複雑な対象へと広がっていくだろう。ここで示したプロトコールがそうした研究の一助になれば幸いである。

文献

1. Jumper, J., et al., Nature, 596, 583–589 (2021)
2. Abramson, J., et al., Nature, 630, 493–500 (2024)
3. Sala, D., et al., Curr. Opin. Struct. Biol., 81, 10264 (2023)
4. Ohnuki, J., et al., J. Phys. Chem. Lett., 15, 725–732 (2024)
5. Ohnuki, J. & Okazaki, K.-I., J. Phys. Chem. B, 128, 7530–7537 (2024)
6. 富井健太郎 編, AlphaFold時代の構造バイオインフォマティクス実践ガイド（実験医学別冊 最強のステップUPシリーズ）, 羊土社 (2024)
7. Mirdita, M., et al., Nat. Methods, 19, 679–682 (2022)
8. Zerihun, M. B., et al., Bioinformatics, 36, 2264–2265 (2020)
9. Varadi, M., et al., Nucleic Acids Res., 50, D439–D444 (2022)
10. del Alamo, D., et al., eLife, 11, e7575 (2022)
11. Ekeberg, M., et al., Phys. Rev. E, 87, 012707 (2013)