実験の詳細

1. カラムの平衡化

サンプルをロードする前にはランニングバッファーをゲルろ過カラムに流し、ゲルろ過カラムの平衡化を行う必要がある。通常、ゲルろ過カラムの平衡化にはカラム体積の1.5倍以上のバッファーを使用する。クロマトグラフィーシステムの流路に沈殿物や気泡を入れないように、バッファーは使用する前に必ずフィルターを通し脱気する必要がある。沈殿物は流路やカラム上部のフィルターに詰まってしまい、カラムにかかる圧力の上昇の原因になる。また、気泡は流路やカラム内に留まることで圧力が不安定になり、カラムの劣化や結果の再現性の低下につながる。一般的に、バッファーは 0.22 μm メンブレンのフィルターにかけ、脱気は15～30分程度行えば十分である。著者らは、脱気を促すために、バッファーの入った容器に超音波を当てながら減圧を行なっている。フィルターにかけた後は、バッファーにほこりなどが混入しないよう注意して取り扱う必要がある。また、バッファーとクロマトグラフィーシステムの間に温度差がある状態でバッファーをシステムの中に流すと、システムやカラム内に気泡が発生する原因となることから、バッファーの温度をシステム内の温度と同じにしてから使用する。通常は、タンパク質の安定性を考慮し、4℃下でゲルろ過を行う。

バッファーをゲルろ過カラムに流す際は、必ずカラムにかかる圧力を確認しながら行う。各カラムのマニュアルには限界圧（pressure limit）と推奨の流速が記載されているが、カラムにかかる実際の圧力はバッファーの粘性や、カラムの汚れ具合によって大きく異なる。また、カラム内部の溶液を、組成が大きく異なる溶液に置換する場合は、カラム内の圧力が急上昇することがあるので、定期的に圧力を確認する必要がある。本項で用いた ÄKTA や Bio-Rad 社のクロマトグラフィーシステム（NGC Medium-Pressure Chromatography System など）では、圧力の上限及び下限を設定することができる。カラムの破損などを防ぐためにも、この機能を使用することを推奨する。また、再現性の高いゲルろ過解析を行うためには、クロマトグラフィーを止めることなくサンプルの溶出を完遂することが重要である。そのため著者らは、平衡化中のカラム圧力値を参考にして流速を調整し、限界圧の60％～70％程度になる流速で以下の操作を行なっている。

2. サンプルのロード

ゲルろ過カラムにロードできるサンプルの体積は、カラム体積に依存する。ゲルろ過カラムの分離能は、ロードするサンプルの体積が大きすぎると低下する。Cytiva（旧 GE Healthcare）はカラム体積の4％以下の体積のサンプル量であれば分離が可能としており、より良い分離能を得るためには、サンプル量をカラム体積の2％以下にすることを推奨している。なお、著者らがゲルろ過を行う際には、通常サンプル量をカラム体積の1％程度としている。サンプルはフィルター（5～0.22 μm）を通すか、遠心（2,000‒3,000 × g, 5 min, 4℃）してその上清を回収することにより、不溶性の沈殿物を取り除く。本項の実験では、Superdex 200 10/300 GL ゲルろ過カラム（カラム体積が約 24 mL）を使用し、検量線用の分子量マーカーも含めて全てのサンプルの体積を 250 μL になるように調製した。本実験では 500 μL サンプルループを使用し、サンプル溶出時の最初の 1 mL はサンプルループを経由するように設定することで、サンプルループや流路にサンプルが残らないようにした。

3. サンプルの溶出

ÄKTA や NGC クロマトグラフィーシステムを用いてゲルろ過カラムから溶出されたサンプルを分画する際に、フラクションの体積に注意する必要がある。ÄKTA や NGC クロマトグラフィーシステムでは、溶出液の吸光度（280 nm および 260 nm）を連続的に測定するので、通常、その情報を元にタンパク質が含まれていると予想されるフラクションの一部を SDS-PAGE で分離し、目的タンパク質が含まれているかを調べる。本項ではフラクションの体積を 500 μL に設定した。1つの溶出ピーク内においても、溶出体積の違いによってタンパク質の純度・形状・活性などが異なる場合がある。そのため、目的に応じてフラクションの体積を変える必要がある。例えば、なるべく濃度が高いサンプルが必要な場合は、各フラクションの体積を小さく（例：150 μL）設定することで溶出ピークの頂点付近のフラクションを回収することができる。また、クロマトグラフィーシステムで回収できるフラクションの数には限りがあることから、カラム体積の大きいカラム（HiLoad など）を用いる際には、排除体積からフラクションの採取を開始したり、溶出ピークのみを採取するように設定することで、目的サンプルの溶出ピークを細かく分画することができる。

4. カラムの洗浄

Cytiva 社のマニュアルでは、Superdex シリーズのゲルろ過カラムを10～20回使用する毎に NaOH 溶液で洗浄することを推奨している。今回の実験では、異なるサンプルの混入の危険性を防ぐために、各サンプルをロードする前にカラムの洗浄を行った。そのため、同じタンパク質を複数回に分けて精製する際には、以下のカラムの洗浄を必ずしも行う必要はない。通常の Superdex の洗浄（マニュアルに記載）では、まず1カラム体積分以上の Milli-Q 水をカラムへ流し、バッファーをカラムから洗い流す。次に1カラム体積分の 0.5 M NaOH を流したのちに、2カラム体積以上の Milli-Q 水をカラムに流す。一方、筆者らはカラムを簡易的に洗浄するため、カラムへ 0.5 M NaOH を 5 mL 程度ロードした後に、1カラム体積分の Milli-Q 水で洗浄した。その後、2カラム体積分のランニングバッファーでカラムを再平衡化し、次のサンプルの解析を行った。なお、洗浄に用いる溶液や手法については、各カラム担体によって多少異なるので、必ずマニュアルを確認することを勧める。

5. サンプルのゲルろ過解析

上記の方法で、Rad52 C 末端側断片（Rad52^233-504）、Rad51、Rad52^233-504 と Rad51 混合溶液のゲルろ過解析を行った結果を示す（図3A）。Rad52^233-504 は 13 mL 付近に、Rad51 は 11 mL 付近に溶出されたが、Rad52^233-504 と Rad51 を混合した際には、12 mL 付近に主要な溶出ピークが検出された。混合液にて検出された溶出ピークは、Rad52^233-504 単体よりも溶出体積が小さかったことから、Rad52^233-504 は Rad51 と相互作用したことが考えられた。実際、混合溶液の溶出ピークを SDS-PAGE で解析した結果、Rad52^233-504 と Rad51 両方のタンパク質が検出され（図3B）、Rad52^233-504 と Rad51 が複合体を形成していることが示唆された。また一方で、Rad51 単独時の溶出ピークは Rad51 単量体の分子量から推測される溶出体積よりもはるかに小さい体積で溶出しており、これまでの報告と同様に Rad51 が多量体を形成していることがわかる。しかし、混合液にて検出された溶出ピークはこの Rad51 多量体の溶出ピークより溶出体積が大きく、Rad52^233-504 が Rad51 と結合すると、Rad51 どうしの会合状態が変化もしくは会合そのものが阻害されることが示唆された（引用3）。

ゲルろ過解析により分子量を求めるには、分子量が既知のタンパク質（分子量マーカー）の溶出体積から作成した検量線を用いる。ÄKTA クロマトグラフィーシステムの場合、UNICORN software 内のpeak integrate の機能を使用すると容易に溶出体積を求めることができる。排除体積の検出には、分子量マーカーのキットに含まれている Blue Dextran を使用した。縦軸は分子量（対数目盛）、横軸を以下の式から算出した \(\mathrm{K_{av}}\) 値をプロットし、その近似直線を検量線とした（図4）。検量線の式に目的タンパク質の \(\mathrm{K_{av}}\) 値を代入することにより、おおよその分子量を算出することができる。なお、ランニングバッファーの組成および流速は溶出体積に影響を与える可能性があるため、分子量マーカーの解析は目的サンプルと同じ条件で行う必要がある。

\[ \mathrm{K_{av}} = \frac{\text{（溶出体積）} − \text{（排除体積）}}{\text{（カラム体積）} − \text{（排除体積）}} \]

ゲルろ過解析により求めたRad52^233-504、Rad51、Rad52^233-504–Rad51 複合体の分子量を示す（表1）。さらにゲルろ過によって精製したサンプルは超遠心分析でも分子量の算出を行なった。なお、Rad51 は会合状態が不均一であるため、超遠心分析を行っていない。ゲルろ過で求めた分子量は、アミノ酸配列から算出されたタンパク質の理論値に比べて、かなり大きかった。このような場合には、タンパク質が会合状態を形成していることや球状タンパク質とは異なる形状の構造を有していることが考えられる。しかし、超遠心分析の結果では、Rad52^233-504 および Rad52^233-504–Rad51 複合体は理論値に近い値であることから、溶液中において、Rad52^233-504 は単量体、Rad52^233-504–Rad51 複合体はヘテロ二量体を形成し、その構造は球状タンパク質とは大きく異なることが考えられた。

このようにゲルろ過は、溶出体積や溶出ピークの形状を調べることで、比較的容易に標的タンパク質の構造の均一性、分子量、複合体形成を解析することができる。近年、クライオ電子顕微鏡によるタンパク質の構造解析技術の著しい発展や、プロテオミクス解析の感度向上に伴い、精製度の高いタンパク質（もしくはタンパク質複合体）の調製が求められる機会が増えている。そうした状況の中、比較的古い実験手法であるゲルろ過の有用性が再認識されている。

表1：各解析法により求められるタンパク質の分子量

	ゲルろ過解析（kDa）	超遠心分析（kDa）	理論値（kDa）
Rad52233-504	122.7	28.9	30.1
Rad51	298.6	–‒	42.9
Rad52233-504–Rad51	181.5	73.1	73.1

タンパク質の理論値については、各タンパク質のアミノ酸配列をもとにして ExPASy の ProtParam tool を使用して求めた（https://web.expasy.org/protparam/）。

文献

1. 岡澤 敦司, 生物工学会誌, 93(6):345–48, ザ・ヒストリー・オブ・クロマトグラフィー (2015)
2. Cytiva（旧 GE Healthcare）, Gel filtration principles and Method (2003)
3. Kagawa W., Arai N., Ichikawa Y., Saito K., Sugiyama S., Saotome M., Shibata T. and Kurumizaka H., Nucleic Acids Research, 42(2):941‒951 (2014)
4. ゲル濾過担体選択ガイド（Cytiva）, https://www.cytivalifesciences.co.jp/newsletter/biodirect_mail/technical_tips/pdf/selection_guide.pdf

実験の詳細

1. カラムの平衡化

サンプルをロードする前にはランニングバッファーをゲルろ過カラムに流し、ゲルろ過カラムの平衡化を行う必要がある。通常、ゲルろ過カラムの平衡化にはカラム体積の1.5倍以上のバッファーを使用する。クロマトグラフィーシステムの流路に沈殿物や気泡を入れないように、バッファーは使用する前に必ずフィルターを通し脱気する必要がある。沈殿物は流路やカラム上部のフィルターに詰まってしまい、カラムにかかる圧力の上昇の原因になる。また、気泡は流路やカラム内に留まることで圧力が不安定になり、カラムの劣化や結果の再現性の低下につながる。一般的に、バッファーは 0.22 μm メンブレンのフィルターにかけ、脱気は15～30分程度行えば十分である。著者らは、脱気を促すために、バッファーの入った容器に超音波を当てながら減圧を行なっている。フィルターにかけた後は、バッファーにほこりなどが混入しないよう注意して取り扱う必要がある。また、バッファーとクロマトグラフィーシステムの間に温度差がある状態でバッファーをシステムの中に流すと、システムやカラム内に気泡が発生する原因となることから、バッファーの温度をシステム内の温度と同じにしてから使用する。通常は、タンパク質の安定性を考慮し、4℃下でゲルろ過を行う。

バッファーをゲルろ過カラムに流す際は、必ずカラムにかかる圧力を確認しながら行う。各カラムのマニュアルには限界圧（pressure limit）と推奨の流速が記載されているが、カラムにかかる実際の圧力はバッファーの粘性や、カラムの汚れ具合によって大きく異なる。また、カラム内部の溶液を、組成が大きく異なる溶液に置換する場合は、カラム内の圧力が急上昇することがあるので、定期的に圧力を確認する必要がある。本項で用いた ÄKTA や Bio-Rad 社のクロマトグラフィーシステム（NGC Medium-Pressure Chromatography System など）では、圧力の上限及び下限を設定することができる。カラムの破損などを防ぐためにも、この機能を使用することを推奨する。また、再現性の高いゲルろ過解析を行うためには、クロマトグラフィーを止めることなくサンプルの溶出を完遂することが重要である。そのため著者らは、平衡化中のカラム圧力値を参考にして流速を調整し、限界圧の60％～70％程度になる流速で以下の操作を行なっている。

2. サンプルのロード

ゲルろ過カラムにロードできるサンプルの体積は、カラム体積に依存する。ゲルろ過カラムの分離能は、ロードするサンプルの体積が大きすぎると低下する。Cytiva（旧 GE Healthcare）はカラム体積の4％以下の体積のサンプル量であれば分離が可能としており、より良い分離能を得るためには、サンプル量をカラム体積の2％以下にすることを推奨している。なお、著者らがゲルろ過を行う際には、通常サンプル量をカラム体積の1％程度としている。サンプルはフィルター（5～0.22 μm）を通すか、遠心（2,000‒3,000 × g, 5 min, 4℃）してその上清を回収することにより、不溶性の沈殿物を取り除く。本項の実験では、Superdex 200 10/300 GL ゲルろ過カラム（カラム体積が約 24 mL）を使用し、検量線用の分子量マーカーも含めて全てのサンプルの体積を 250 μL になるように調製した。本実験では 500 μL サンプルループを使用し、サンプル溶出時の最初の 1 mL はサンプルループを経由するように設定することで、サンプルループや流路にサンプルが残らないようにした。

3. サンプルの溶出

ÄKTA や NGC クロマトグラフィーシステムを用いてゲルろ過カラムから溶出されたサンプルを分画する際に、フラクションの体積に注意する必要がある。ÄKTA や NGC クロマトグラフィーシステムでは、溶出液の吸光度（280 nm および 260 nm）を連続的に測定するので、通常、その情報を元にタンパク質が含まれていると予想されるフラクションの一部を SDS-PAGE で分離し、目的タンパク質が含まれているかを調べる。本項ではフラクションの体積を 500 μL に設定した。1つの溶出ピーク内においても、溶出体積の違いによってタンパク質の純度・形状・活性などが異なる場合がある。そのため、目的に応じてフラクションの体積を変える必要がある。例えば、なるべく濃度が高いサンプルが必要な場合は、各フラクションの体積を小さく（例：150 μL）設定することで溶出ピークの頂点付近のフラクションを回収することができる。また、クロマトグラフィーシステムで回収できるフラクションの数には限りがあることから、カラム体積の大きいカラム（HiLoad など）を用いる際には、排除体積からフラクションの採取を開始したり、溶出ピークのみを採取するように設定することで、目的サンプルの溶出ピークを細かく分画することができる。

4. カラムの洗浄

Cytiva 社のマニュアルでは、Superdex シリーズのゲルろ過カラムを10～20回使用する毎に NaOH 溶液で洗浄することを推奨している。今回の実験では、異なるサンプルの混入の危険性を防ぐために、各サンプルをロードする前にカラムの洗浄を行った。そのため、同じタンパク質を複数回に分けて精製する際には、以下のカラムの洗浄を必ずしも行う必要はない。通常の Superdex の洗浄（マニュアルに記載）では、まず1カラム体積分以上の Milli-Q 水をカラムへ流し、バッファーをカラムから洗い流す。次に1カラム体積分の 0.5 M NaOH を流したのちに、2カラム体積以上の Milli-Q 水をカラムに流す。一方、筆者らはカラムを簡易的に洗浄するため、カラムへ 0.5 M NaOH を 5 mL 程度ロードした後に、1カラム体積分の Milli-Q 水で洗浄した。その後、2カラム体積分のランニングバッファーでカラムを再平衡化し、次のサンプルの解析を行った。なお、洗浄に用いる溶液や手法については、各カラム担体によって多少異なるので、必ずマニュアルを確認することを勧める。

5. サンプルのゲルろ過解析

上記の方法で、Rad52 C 末端側断片（Rad52^233-504）、Rad51、Rad52^233-504 と Rad51 混合溶液のゲルろ過解析を行った結果を示す（図3A）。Rad52^233-504 は 13 mL 付近に、Rad51 は 11 mL 付近に溶出されたが、Rad52^233-504 と Rad51 を混合した際には、12 mL 付近に主要な溶出ピークが検出された。混合液にて検出された溶出ピークは、Rad52^233-504 単体よりも溶出体積が小さかったことから、Rad52^233-504 は Rad51 と相互作用したことが考えられた。実際、混合溶液の溶出ピークを SDS-PAGE で解析した結果、Rad52^233-504 と Rad51 両方のタンパク質が検出され（図3B）、Rad52^233-504 と Rad51 が複合体を形成していることが示唆された。また一方で、Rad51 単独時の溶出ピークは Rad51 単量体の分子量から推測される溶出体積よりもはるかに小さい体積で溶出しており、これまでの報告と同様に Rad51 が多量体を形成していることがわかる。しかし、混合液にて検出された溶出ピークはこの Rad51 多量体の溶出ピークより溶出体積が大きく、Rad52^233-504 が Rad51 と結合すると、Rad51 どうしの会合状態が変化もしくは会合そのものが阻害されることが示唆された（引用3）。

ゲルろ過解析により分子量を求めるには、分子量が既知のタンパク質（分子量マーカー）の溶出体積から作成した検量線を用いる。ÄKTA クロマトグラフィーシステムの場合、UNICORN software 内のpeak integrate の機能を使用すると容易に溶出体積を求めることができる。排除体積の検出には、分子量マーカーのキットに含まれている Blue Dextran を使用した。縦軸は分子量（対数目盛）、横軸を以下の式から算出した \(\mathrm{K_{av}}\) 値をプロットし、その近似直線を検量線とした（図4）。検量線の式に目的タンパク質の \(\mathrm{K_{av}}\) 値を代入することにより、おおよその分子量を算出することができる。なお、ランニングバッファーの組成および流速は溶出体積に影響を与える可能性があるため、分子量マーカーの解析は目的サンプルと同じ条件で行う必要がある。

\[ \mathrm{K_{av}} = \frac{\text{（溶出体積）} − \text{（排除体積）}}{\text{（カラム体積）} − \text{（排除体積）}} \]

ゲルろ過解析により求めたRad52^233-504、Rad51、Rad52^233-504–Rad51 複合体の分子量を示す（表1）。さらにゲルろ過によって精製したサンプルは超遠心分析でも分子量の算出を行なった。なお、Rad51 は会合状態が不均一であるため、超遠心分析を行っていない。ゲルろ過で求めた分子量は、アミノ酸配列から算出されたタンパク質の理論値に比べて、かなり大きかった。このような場合には、タンパク質が会合状態を形成していることや球状タンパク質とは異なる形状の構造を有していることが考えられる。しかし、超遠心分析の結果では、Rad52^233-504 および Rad52^233-504–Rad51 複合体は理論値に近い値であることから、溶液中において、Rad52^233-504 は単量体、Rad52^233-504–Rad51 複合体はヘテロ二量体を形成し、その構造は球状タンパク質とは大きく異なることが考えられた。

このようにゲルろ過は、溶出体積や溶出ピークの形状を調べることで、比較的容易に標的タンパク質の構造の均一性、分子量、複合体形成を解析することができる。近年、クライオ電子顕微鏡によるタンパク質の構造解析技術の著しい発展や、プロテオミクス解析の感度向上に伴い、精製度の高いタンパク質（もしくはタンパク質複合体）の調製が求められる機会が増えている。そうした状況の中、比較的古い実験手法であるゲルろ過の有用性が再認識されている。

表1：各解析法により求められるタンパク質の分子量

	ゲルろ過解析（kDa）	超遠心分析（kDa）	理論値（kDa）
Rad52233-504	122.7	28.9	30.1
Rad51	298.6	–‒	42.9
Rad52233-504–Rad51	181.5	73.1	73.1

タンパク質の理論値については、各タンパク質のアミノ酸配列をもとにして ExPASy の ProtParam tool を使用して求めた（https://web.expasy.org/protparam/）。

文献

1. 岡澤 敦司, 生物工学会誌, 93(6):345–48, ザ・ヒストリー・オブ・クロマトグラフィー (2015)
2. Cytiva（旧 GE Healthcare）, Gel filtration principles and Method (2003)
3. Kagawa W., Arai N., Ichikawa Y., Saito K., Sugiyama S., Saotome M., Shibata T. and Kurumizaka H., Nucleic Acids Research, 42(2):941‒951 (2014)
4. ゲル濾過担体選択ガイド（Cytiva）, https://www.cytivalifesciences.co.jp/newsletter/biodirect_mail/technical_tips/pdf/selection_guide.pdf